微生物对抗菌肽耐受性的研究进展

　　摘要：抗菌素耐药性的日趋严重，使有望作为其替代品的新型抗菌药物——抗菌肽受到越来越广泛的关注。研究人员在其分类、作用机制、生物活性、应用前景等方面都进行了深入的而又卓有成效的研究，但随着越来越多的对抗菌肽不敏感菌株的出现，微生物对抗菌肽的耐受性成了抗菌肽研究过程中不可忽视的环节。国内有关微生物对抗菌肽的耐受性报道较少，本文就近几年国外的研究进展作一综述。

　　关键词：微生物；抗菌肽；耐受性；研究

　　　在传统的观念中，人们一度认为病毒、细菌、真菌能够对任何抗微生物物质产生耐受性，然而抗菌肽再这一点上打破了人们的观点。抗菌素一般是通过抑制细菌的细胞壁、蛋白质或DNA等的合成来发挥作用的，这种作用需要一些特殊受体，所以微生物往往通过基因突变对传统的抗菌素产生耐受性，而抗菌肽一般是通过物理作用造成细胞膜的穿孔，这样就不需要一些特殊的受体。此外，大多数的抗菌肽是由无特点的氨基酸序列组成，缺少一个独特地可被蛋白水解酶识别的抗原决定基，因此微生物要破坏抗菌肽十分不易。抗菌肽的作用目标是细菌的细胞膜，因此微生物要不被抗菌肽攻击，就必须改变其膜的结构。当前的研究主要通过人为地改变细菌细胞膜结构和基因组，获得细菌突变体，从降低细菌细胞膜表面的负电荷、寻找编码细菌药物输出泵和降解抗菌肽的蛋白酶基因等方面着手研究，以期找到微生物对抗菌肽产生耐受性的影响因素。

　　1.细胞膜结构的改变对抗菌肽耐受性的影响

　　早期对大肠杆菌的研究证实外膜结构的waaP基因产物可对LPS内部区域的的第一个庚糖残基进行磷酸化。Jeremy A等[1]等对沙门氏菌血清型Typhimurium的waaP突变体进行研究，结果显示沙门氏菌LPS中心区域的磷酰基的修饰导致LPS的负电荷减少，使沙门氏菌对多粘菌素更加敏感，同时也发现这个突变体在小鼠感染模型中毒性完全丢失。大肠杆菌和鼠伤寒沙门菌类脂A上正电荷、残基如含4-氨基-4-脱氧-l-阿拉伯糖 的胺基和磷酸乙醇胺pEtN的存在对多粘菌素的抗性都具有一定的影响。Tran AX等[2]发现在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中的lpxM基因沉默导致了l-Ara4N的减少，增加了对多粘菌素的敏感性。杀微生物的血小板蛋白相对分子质量较小、为阳离子肽，具有杀灭血液中微生物病原体的活性，对凝血素tPMP-1有抗性的金黄色葡萄球菌可导致人和实验性的心内膜炎。为了解tPMP-1抗性主要成分，Arnold S等[3]比较了三株对tPMP-1、具有抗性tPMP-1r和和敏感菌株tPMP-1s的细胞膜结构和功能的若干个参数。结果证实tPMP-1r菌膜显示更高程度的流动性，进一步确证了金黄色葡萄球菌的细胞膜的特殊修饰与体外tPMP-1抗性密切相关的观点。类脂A磷酸基的修饰如磷酸乙醇胺的形成，降低了革兰氏阴性菌的脂多糖总体负电荷，从而弱化了对阳离子抗菌肽的亲和力。Yih-Ling等[4]发现起初对PxB敏感脑膜炎双球菌的突变体在mtrCDE操纵子内含有编码多种药物输出泵的蛋白的插入序列，同时发现经lptA—磷酸乙醇胺PEA转移酶修饰脂质A首位碱基后获得的突变体可以造成对PxB高的敏感性。Samuel M等[5]分离对多粘菌素具有抗性的绿脓杆菌的突变体，发现这些突变体的类脂A包含着氨基阿拉伯糖，说明类脂A上发生了与多粘菌素抗性相关的修饰。幽门螺旋杆菌类脂A1号位置的修饰是类脂A磷酸酶LpxEHP 切除1-磷酸基和随后在EptAHP 催化作用下，磷酸乙醇胺残基的

　　取代两步过程。An X等[6]将氯霉素抗性的暗盒插入到lpxEHP获得了多种幽门螺旋杆菌的LpxEHP突变体，LpxEHP活性的缺失阻止了多种幽门螺旋杆菌类脂A1号位置修饰，使该菌对多粘霉素的抗性显着的降低。相反，幽门螺旋杆菌对抗菌肽多粘霉素呈现高的抗性。Miguel A等[7]证实肺炎克雷伯菌荚膜多糖突变体对人中性粒细胞防御素1、乳铁蛋白、硫酸鱼精蛋白和多粘菌素的抗性比野生性菌株更强烈。其原因是肺炎克雷伯菌在多粘霉素B和乳铁蛋白的存在下生长时，CPS转录增量调节，从而增加CPS的数量，使细菌细胞膜负电荷降低，减少抗菌肽与其表面的结合。此外，E. Limburg， R等[8]通过对二肽TAN1057耐药的S. aureus 133 和S. aureus RN4220 作为研究对象，证实金黄色葡萄球菌的核糖体和S150片段的核糖体修改导致了此菌对TAN1057的耐药性。受试菌株的MIC值随着TAN 1057稀释浓度的改变呈现一天1或者2个稀释度的阶段性增长。低水平的耐药性可能归因于二肽的转运载体的修饰或者外排泵的翻译；另一个耐药性阶段性增高的的原因是rRNA的突变，更多的rRNA基因突变会导致更高突变核糖体总数。Hiromi Nishi等[9]研究证实金黄色葡萄球菌细胞质膜上的磷脂酰甘油含量的减少可影响对抗菌肽的敏感度。

　　2.基因调控体系在微生物对抗菌肽耐受性中的作用

　　到目前为止，至少26种细胞外膜蛋白的表达被证实由PhoP-PhoQ激活作用调控。绿脓杆菌具有环境中的多样性、巨大的代谢能力和对抗菌素的耐药等特点，Dong H等[10]发现在菌体培养基中添加亚精胺或者其它的聚胺可以增加绿脓杆菌对聚阳离子肽类抗菌素，氨基糖甙类，喹诺酮类的MIC水平。诱导修饰LPS操纵子PA3552-PA3559的二组分系统PhoP-PhoQ所介导外膜蛋白OprH过度表达和增加对抗菌肽的抗性是绿脓杆菌对Mg2+的缺乏而做出的部分适应性反应，外源亚精胺诱导oprH-phoPQ操纵子和修饰LPS操纵子被聚胺新陈代谢和lacZ融合影响的启动子证实。John S等[11]证实鼠伤寒沙门氏菌侵袭力调节器—PhoP-PhoQ活化巨噬细胞内pag基因的转录，对抗菌肽产生抗性。PhoP的活性基因—pagB带有pmrAB的操纵子，通过pagB5端启动子的活化，pmrAB的表达增加了pagB-pmrAB的转录，继而pagB-pmrAB诱导pag基因表达，增加了沙门氏菌对多粘菌素的抗性。Igor E等[12]报道沙门氏菌血清型Typhimurium的mig-14基因在PhoP的控制下，通过一个不完全明了的机制促成了沙门氏菌对抗菌肽的抗性，并且不需要4-氨基阿拉伯糖添加到类脂A的修饰。Tina Guina等[13]证实沙门氏菌裂解酶的表达提高了对a-CAMPs的抗性，但PhoP-PhoQ并不调控PgtE的转录和输出，可能决定了PgtE膜外定位。此外，John S等[14]证实双组分调节系统PmrA-PmrB介导的两个位点pmrE和pmrHFIJKLM.转录使沙门氏菌产生了对多粘菌素、杀菌/渗透性增加蛋白和青霉素类抗菌素的耐药性。pmrE和pmrHFIJKLM可产生用来合成具有4-氨基阿拉伯糖的类脂A所需的物质，这种物质对类脂A的修饰造成LPS负电荷下降，降低了与阳离子抗菌肽的结合作用。

　　3.基因改变对抗菌肽耐受性的影响

　　嗜肺性军团病杆菌是人类单核细胞、巨噬细胞和原虫中的碱性细胞寄生物。Marianne等[15]发现嗜肺性军团病杆菌基因可能编码与沙门氏菌血清型Typhimurium pagP基因产物同源的蛋白。由于在沙门氏菌pagP基因的表达可增加对阳离子抗菌肽的抗性，于是研究人员对宿主细胞巨噬细胞中具有沙门氏菌pagP同源基因的嗜肺性军团病杆菌突变体进行了研究，却发现突变体始终减少感染时细菌的数量以及它们对U937巨噬细胞的病变能力，对不同结构类型的阳离子抗菌肽的抗性降低。Burkholderia cenocepacia是一种重要的条件致病菌，主要来自囊性纤维病的病人，这种菌对抗微生物制剂存在着固有的抗性，其hldA 和hldD基因产物可对LPS进行修饰，Slade A等[16]构建了缺失hldA and hldD基因突变体SAL1，试验结果显示SAL1对多粘霉素B、蜂毒素、嗜中性的肽1敏感。变形链球菌对杆菌肽具有一定的抗性，Hiromasa等[17]克隆获得两个具有抗性的变形链球菌的基因组，其中与鼠李葡萄糖的合成有关的rgp基因组位于rmlD的下游，包含着六个rgp基因，RGP的钝化可以导致对杆菌素大约五倍的敏感性，大致可以与野生性菌株Xc相当。第二个耐药基因由四个mbr基因mbrA， mbrB， mbrC， and mbrD组成，位于gtfC的下游，编码不溶于水的葡聚糖酶，mbrA， mbrB， mbrC或者mbrD缺失的变异体的敏感性比Xc高100-120倍。Lina等[18]试验中发现肺支原体对亚抑菌浓度状态下的蜂毒肽或杆菌肽D的抗性增强，并存在交叉耐药现象。在支原属中，缺乏σ转录起始因子的细菌，HrcA蛋白作为热激蛋白的负调节物发挥关键作用，这表明肺炎支原体对两种抗菌肽的抗性可能起因于HrcA调节基因参与的应急性反应。Min cao等[19]发现了一个枯草杆菌重要的杆菌肽抗性决定簇，编码杆菌肽外排泵的bcrC 基因，缺失bcrC基因的突变体枯草杆菌对杆菌肽的敏感度增加了约8倍。Ulvatne H等[20]证实乳铁蛋白B对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌活性受到蛋白酶抑制剂钠-EDTA和蛋白酶基因的缺失的影响，其中编码丝氨酸蛋白酶的DegP基因缺失导致大肠杆菌对乳铁蛋白B敏感性升高。

　　4.氨基酸置换对抗菌肽耐受性的影响

　　抗菌肽B17是一类主要通过作用DNA解旋酶阻断大肠杆菌DNA复制的肽类抗菌素， Francisco J等[21]删除或替换大肠杆菌中与DNA解旋酶中的色氨酸751，改变了DNA解旋酶的活性，导致大肠杆菌对B17不同水平的耐药性。

　　另外，文献[22]报道一些不敏感的菌株，如摩根氏菌属和沙门氏菌属，其外膜缺少合适的酸性脂质密度，失去了与抗菌肽作用的位点。其它的不敏感菌株，如牙龈卟啉单胞菌，能够分泌出特殊的蛋白酶来水解抗菌肽。在对抗菌肽的获得性耐受所作的研究基本上证实了这些蛋白酶对应的基因，这些基因在被破坏时，微生物对抗菌肽的敏感性就会加强。

　　结束语

　　抗菌肽以其抗菌谱广、不易产生耐药性、体内无药物残留等独特的优点正受到人们亲睐，但随着抗菌素耐药性的日趋严重和越来越多对抗菌肽不敏感菌株的出现，人们也开始担心抗菌肽作为新型抗菌药物应用临床后是否也会象抗菌素一样出现耐药性。研究可见微生物要对抗菌肽产生耐受性，就要改变细胞膜的结构，或通过间接降低膜表面的电荷数，弱化与抗菌肽的结合作用；或通过自身相关基因发生突变，表达外排药物的蛋白和降解抗菌肽的酶等方式使抗菌肽的抗菌作用降低或失效，这对自然界中的微生物而言，是相当困难的。抗菌肽方面，影响其活性的因素较多，除了作用环境中的因素如介质离子强度、PH值等外，自身分子的铰链[23]、氨基酸构象的改变等也可影响抗菌肽的抗菌效果，当前研究人员从抗菌肽自身结构及其与受体间的相互作用等方面入手，以期降低影响因素的不利水平，提高抗菌肽的生物学活性。目前为止，临床和实验所进行的研究证实了抗菌肽所引起的微生物耐受性与传统抗菌素相比，微乎其微。这表明抗菌肽可以部分或者将来完全替代抗菌素缓解在临床上出现的日益棘手的细菌对传统抗菌素产生耐药性问题，但对其将来出现耐药性的可能性也应引起畜牧业研究领域足够的重视。